德國(guó)拜發(fā)公司 華南地區(qū)總代理 廣州市瑞品生物技術(shù)有限公司

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德國(guó)拜發(fā)d-異檸檬酸試劑盒

酶法分析試劑盒，用于檢測(cè)食品飲料中的d－異檸檬酸含量，每個(gè)試劑盒約33次測(cè)試，是目前檢測(cè)果汁飲料中果汁含量的國(guó)標(biāo)方法。

d-異檸檬酸試劑盒（酶學(xué)試劑盒）
酶法分析試劑盒（紫外分光光度法）
ridascreen（產(chǎn)品編號(hào)：0 414 433） 30次檢測(cè)
1. 簡(jiǎn)介
此法適用于食品（果汁、含果汁飲料、水果類產(chǎn)品）和一些物質(zhì)中d-異檸檬酸，d-異檸檬酸內(nèi)酯及d-異檸檬酸酯類的檢測(cè)。

2. 原理
d-異檸檬酸在輔酶ⅱ及d-異檸檬酸脫氫酶作用下可氧化脫羧生成2-酮戊二酸，二氧化碳及還原型輔酶ⅱ樣； 反應(yīng)式為
d-異檸檬酸脫氫酶
d-isocitrate +nadp﹢ 2-oxoglutarate +co2 +nadph + h+
其中nadph的量取決于d-異檸檬酸的量，nadph可在334nm，340nm，365nm下進(jìn)行測(cè)定。

環(huán)狀的d-異檸檬酸酯類及內(nèi)酯類經(jīng)氫氧化鈉水解后可按上述原理進(jìn)行測(cè)定； 反應(yīng)式為
ph9-10
d-異檸檬酸酯類 + 水 d-異檸檬酸+乙醇
ph9-10
d-異檸檬酸內(nèi)酯類 + 水 d-異檸檬酸

3. 試劑盒內(nèi)容物
----瓶1約30ml溶液，包括：咪唑緩沖液，ph約7.1
----瓶2約60mg冷凍干燥物，包括：nadp 約45mg；硫酸錳
----瓶3為d-異檸檬酸脫氫酶冷凍干燥物約5u

4. 檢測(cè)溶液的制備
----用瓶1中所有溶液溶解瓶2中內(nèi)容物，形成溶液2
----用1.8ml重蒸水溶解瓶3內(nèi)容物形成溶液3

5. 操作者應(yīng)該注意之事項(xiàng)
----d-異檸檬酸檢測(cè)中使用的試劑對(duì)人無(wú)毒害，但仍要遵守所有化學(xué)試劑都要遵守的一般全規(guī)則
----使用過(guò)的試劑放入實(shí)驗(yàn)室垃圾桶，如有需要在保留

6. 儲(chǔ)存條件
----瓶1需在2-8℃下保存（見(jiàn)標(biāo)簽），溶液1使用前需回至室溫20-25℃
----瓶2需保存在2-8℃(見(jiàn)標(biāo)簽)，溶液2在2-8℃下可保存4周，-15℃到-25℃下可保存約兩個(gè)月
----瓶3需在2-8℃下保存（見(jiàn)標(biāo)簽），溶液3在2-8℃下可保存4周，-15℃到-25℃下可保存約兩個(gè)月

7. 樣品處理
----直接取用無(wú)色，透明，中性的溶液或按稀釋表格進(jìn)行稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，體積為2.000ml
----過(guò)濾混濁溶液
----除去樣品溶液中的二氧化碳?xì)怏w
----加入氫氧化鈉或氫氧化鉀來(lái)調(diào)節(jié)酸溶液的ph值約為8
----加入氫氧化鈉或氫氧化鉀來(lái)調(diào)節(jié)酸溶液或淡顏色的溶液的ph值至7-7.5，并孵育約30分鐘
----用高氯酸或三氯乙酸除去樣品中包被的蛋白質(zhì)，而后用carrez試劑澄清
----用熱水抽提樣品中的脂肪（抽提溫度需高于該脂肪的熔點(diǎn)），冷卻后分去脂肪，而后移至容量瓶中并加水至刻度線在冰浴中放置15分鐘，過(guò)濾；熱

水抽提后用carrez試劑澄清
----用三氯乙酸或carrez試劑除去乳劑

8. 過(guò)程
1. 波長(zhǎng)：340nm,hg365nm或hg334nm
2. 比色杯：光徑1.0cm
3. 溫度：20-25℃
4. Zui終體積：3.050ml
5. 對(duì)照空氣（光路上無(wú)比色杯）或?qū)φ账x取讀數(shù)
6. 樣品溶液：2-100ugd-異檸檬酸\檢測(cè)（0.100-2.000ml樣品溶液）
7. 具體操作見(jiàn)如下表格

移液 空白（ml） 樣品（ml）
溶液2
樣品溶液
重蒸水 1.000
-
2.000 1.000
0.100
1.900
混和，約在3分鐘后讀取吸光度值a1，而后加入下列物質(zhì)。
溶液3 0.050 0.050
混和，反應(yīng)進(jìn)行10分鐘后讀取吸光度值a2。
如果反應(yīng)在10分鐘后沒(méi)有停止，繼續(xù)以2分鐘的間隔讀取讀數(shù)，直至吸光度值在2分鐘后不斷增加。

分別測(cè)樣品與空白的吸光度值差，而后用樣品吸光度值差減去空白吸光度值差可以得到如下公式
△a=(a2―a1)sample―(a2―a1)blank

9. 計(jì)算
根據(jù)以下公式計(jì)算濃度
v×mw
c= --------------------×△a(g/l)
ε×d×v×1000

v=Zui終體積（ml）
v=樣品體積（ml）
mw=被檢測(cè)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量
d=光徑（cm）
ε=nadh的消光系數(shù)
340nm=6.3(1×mmol-1×cm-1)
hg365nm=3.4(1×mmol-1×cm-1)
hg334nm=6.18(1×mmol-1×cm-1)

d-異檸檬酸含量計(jì)算遵守如下公式
3.050×192.1
c= -----------------------------×△a
ε×1.00×0.100×1000

5.859
= --------------×△a（g d-異檸檬酸/l樣品溶液）
ε
如果樣品溶液是稀釋使用的，在計(jì)算結(jié)果時(shí)需乘以稀釋系數(shù)f。
當(dāng)分析固體或半固體時(shí)，測(cè)量前需稱一定重量配制樣品溶液，其結(jié)果需按下式計(jì)算

c d-異檸檬酸（g/l樣品溶液）
cd-異檸檬酸 =-----------------------------×100（g/100g）
w d-異檸檬酸（在樣品溶液中）

10. 檢測(cè)操作說(shuō)明
被檢測(cè)樣品中d-異檸檬酸的量若在3ug和100ug之間，可在365nm下測(cè)量，若在2ug和50ug之間，可在340nm，334nm下測(cè)量。為了得到一個(gè)足夠的吸光度值

樣品溶液需稀釋，其中d-異檸檬酸的濃度在0.2和1.0g/l或0.1和0.5g/l。

稀釋表格
每升溶液乳糖，d-半乳糖估計(jì)量

340或334nm 365nm 用水
稀釋 稀釋
倍數(shù)
<0.5g
0.5-5.0g
>5.0g <1g
1.0-10.0g
>10.0g -
1+9
1+99 1
10
100
如果吸光度值較低，例如低于0.100，樣品溶液需重新配制，可由下列幾種解決方法
1. 可多稱出些樣品或不要過(guò)分稀釋。
2.加入到比色杯中的溶液體積可增加至2.000ml，若可能需中和樣品溶液。當(dāng)然為了得到相同的Zui終體積（樣品和空白），加入的水的體積就要相應(yīng)減

少。所加入的新溶液的體積在計(jì)算時(shí)是要考慮進(jìn)去的。

11. 技術(shù)信息
1. 果汁分析中wallrauch沉淀技術(shù)應(yīng)用較為廣泛。
2. 當(dāng)檢測(cè)強(qiáng)酸樣品時(shí)（如葡萄汁），氨溶液的體積需要增加：需加至2.5ml否則結(jié)果會(huì)偏低，在檢測(cè)前中和強(qiáng)酸樣品。
3.在做重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)d，l-異檸檬酸三鈉二水化合物將會(huì)被考慮進(jìn)來(lái)，其分子量也會(huì)被應(yīng)用，另外在酶促反應(yīng)中只有d-型反應(yīng)才會(huì)被考慮。

12. 特性
1. 異檸檬酸脫氫酶特異性地催化氧化d-異檸檬酸脫去二氧化碳。
2.制備好的d-異檸檬酸脫氫酶中可能會(huì)含有l(wèi)-蘋果酸脫氫酶和烏頭酸酶，盡管如此，l-蘋果酸過(guò)量100倍及檸檬酸過(guò)量200倍也不會(huì)影響d-異檸檬酸的檢

測(cè)，若樣品中含有大量的l-蘋果酸和檸檬酸，那么樣品基質(zhì)的蠕變反應(yīng)可通過(guò)判斷來(lái)消除。
3. 在檢測(cè)工業(yè)d，l-異檸檬酸三鈉的二水化合物時(shí)其中大約有50%可被檢測(cè)出來(lái)（因其中只有d-型可進(jìn)行酶促反應(yīng)）

13. 靈敏度
Zui小吸光度值差為0.5個(gè)吸光單位，相應(yīng)的Zui大溶液體積為v=2.000ml，340nm下d-異檸檬酸濃度為0.25mg/l；若樣品體積v=0.100ml，相應(yīng)的d-異檸檬酸

濃度為5mg/l。